La Sindrome da Ipoventilazione Centrale Congenita

La sindrome da ipoventilazione centrale congenita (CCHS), anche nota come Sindrome di Ondine, rappresenta un`entità molto rara caratterizzata da un`anormale risposta ventilatoria all`ipossia e all`ipercapnia, dovuta al mancato controllo della respirazione autonoma. I bambini CCHS mostrano una ventilazione adeguata durante la veglia ma insufficiente durante il sonno. La mancata diagnosi o il trattamento inadeguato possono essere responsabili di morte o di danni neurologici anche molto gravi, dovuti a sofferenza ipossica cerebrale secondaria alle crisi di apnea. Inoltre, la dimissione di questi bambini dagli ospedali viene spesso ritardata a causa di problemi con la gestione domiciliare del controllo della respirazione, dovuti a carenze delle strutture territoriali. La CCHS colpisce circa 1 bambino su 200000 nati vivi e, attualmente, circa 40 bambini in Italia sono affetti da questa malattia. Ad oggi, CCHS appare come un disordine cronico poichè nessun farmaco è risultato essere efficace nello stimolare la funzione respiratoria, così che supporti ventilatori quali tracheostomia, maschera nasale o pace maker diaframmatici, stimolante il nervo frenico, rappresentano le uniche opzioni disponibili per i bambini affetti da CCHS. L`American Thoracic Society ha trattato questi ed altri aspetti, dettando raccomandazioni ormai riconosciute come linee guida di base per questi pazienti (1), raccomandazioni che stanno per essere aggiornate da un Comitato nominato per l’occasione, ed al quale siamo stati invitati a prendere parte. In aggiunta, l’Associazione Americana famiglie CCHS ha pubblicato i risultati di un recente survey internazionale sulle condizioni cliniche, psicologiche e sociali dei bambini CCHS e dei loro familiari (2).

Sebbene la valutazione iniziale di sospetto CCHS dovrebbe escludere la presenza di difetti neuro-anatomici alla base della ridotta funzionalità del sistema autonomo, abbiamo dimostrato anomalie del tronco encefalico in due pazienti CCHS (3). CCHS può presentarsi, in una notevole proporzione di casi, in associazione con altre neurocristopatie tra cui il neuroblastoma, il ganglioneuroma e il ganglioneuroblastoma, in aggiunta a numerose altre disfunzioni del sistema nervoso autonomo come il reflusso gastro-esofageo, la costipazione, le aritmie cardiache, i disordini oculari e neuroendocrini, la malattia di Hirschsprung (HSCR) etc. (1,2).

Mutazioni del gene PHOX2B e correlazione genotipo-fenotipo

L`eziologia genetica della CCHS, da tempo sostenuta dall’aumentato rischio di ricorrenza in fratrie, dall’associazione con la malattia di Hirschsprung (HSCR) ed altre neurocristopatie, e dall’esistenza di modelli animali che mostrano un fenotipo respiratorio simile a CCHS, è stata definitivamente confermata dall’identificazione di difetti del gene PHOX2B in eterozigosi in circa il 90% dei pazienti CCHS (4-6). Per questi ultimi è stata dunque dimostrata una trasmissione autosomica dominante con penetranza incompleta, come suggerito dall’osservazione di genitori portatori asintomatici di mutazioni PHOX2B.

Il gene PHOX2B è costituito da tre esoni che codificano per un fattore di trascrizione di 314 aminoacidi espresso in diversi distretti del sistema nervoso autonomo ed in particolare nel midollo allungato, nel sistema nervoso periferico, nei centri noradrenergici e in specifici gruppi di neuroni coinvolti nel controllo dei riflessi delle funzioni autonomiche (7). La proteina PHOX2B è caratterizzata da un dominio omeobox di legame al DNA di 60 aminoacidi codificato dall’esone 2 e da due tratti rispettivamente di 9 e 20 residui ripetuti di alanina nell’esone 3.

La maggior parte di pazienti con mutazione di PHOX2B è caratterizzata da una duplicazione in frame di un numero variabile tra 15 e 39 nucleotidi all’interno del tratto omopolimerico dell’esone 3 codificante per 20 alanine, che porta dunque ad un’inserzione di un numero variabile tra 5 e 13 residui di alanina (Figura 1) (5,6,8). Nei restanti pazienti sono state identificate inserzioni o delezioni di un nucleotide nell’esone 3 di PHOX2B che determinano lo slittamento del codice di lettura della proteina, a cui consegue la formazione di un prodotto proteico caratterizzato da una regione C-terminale aberrante (mutazioni frameshift), nonchè rarissime mutazioni nonsenso e missenso dell’esone 2.

Ad oggi, sono giunti alla nostra attenzione 72 pazienti CCHS di cui 64 (89%) presentano una mutazione nel gene PHOX2B che nell’83% dei casi è rappresentata da un’espansione poli-alanina. Tra i pazienti con mutazioni, 6 l’hanno ereditata da un genitore portatore asintomatico, 1 da un genitore sintomatico; nei restanti casi la mutazione si presenta de novo.

E’ stata osservata una stretta correlazione tra la lunghezza del tratto espanso di alanine e la severità del fenotipo respiratorio; in particolare, i pazienti CCHS caratterizzati dalle duplicazioni più lunghe di alanine (+11 e +13) necessitano di un supporto alla ventilazione sia di giorno che di notte; al contrario, i pazienti CCHS caratterizzati dalle espansioni più corte (+5) mostrano un fenotipo assai meno grave, che talvolta può insorgere tardivamente (casi “late-onset”) o mostrare penetranza incompleta (6,9). Il numero e la gravità dei sintomi associati, incluso HSCR e neuroblastoma, sembrano invece correlare con la presenza delle mutazioni frame shift e missenso (8). Questa correlazione genotipo-fenotipo suggerisce che in CCHS l’insorgenza e la severità della malattia possono essere predette con buona approssimazione.

Studi funzionali

PHOX2B è risultato necessario per la corretta espressione sia di DbH (Dopamina-b-idrossilasi) che di TH (Tirosina idrossilasi), due geni codificanti per gli omonimi enzimi coinvolti nella biosintesi delle catecolamine, e per il mantenimento dell’espressione di MASH1 (Mammalian Achaete-Scute Homologue-1). Osservazioni effettuate nel nostro laboratorio hanno inoltre mostrato che PHOX2B è coinvolto nella regolazione trascrizionale del proto-oncogene RET (10) e del gene codificante la proteina con omeodominio TLX-2, la cui espressione è necessaria allo sviluppo del sistema nervoso enterico (11). Inoltre, PHOX2B regola PHOX2A, il cui prodotto proteico è necessario per la formazione del locus coeruleus ed espresso in tutti i neuroni che, transientemente o permanentemente, mostrano un fenotipo noradrenergico (12). La conoscenza di alcuni bersagli trascrizionali ci ha stimolato ad indagare gli effetti delle mutazioni associate a CCHS sull’attività di PHOX2B. L’utilizzo di appropriati costrutti di DNA (sequenze geniche capaci di esprimersi in un contesto cellulare in vitro) in esperimenti di co-trasfezione cellulare con le regioni regolatorie dei geni DbH e PHOX2A ci ha consentito di dimostrare che espansioni di polialanine e mutazioni frameshift, inducono effetti diversi nella regolazione trascrizionale dei geni bersaglio di PHOX2B (Figura 2A) (13). In particolare, in accordo alla correlazione genotipo-fenotipo già riportata, abbiamo dimostrato un progressivo decremento dell’attivazione trascrizionale dei promotori bersaglio all’aumentare della lunghezza del tratto espanso di polialanine. Inoltre, le espansioni di polialanine sono risultate in una ritenzione citoplasmatica lunghezza-dipendente della proteina con formazione di aggregati sia nucleari che citosolici (Figura 2B). Abbiamo dunque studiato i meccanismi adottati dalle cellule per contrastare gli effetti patogenetici e tossici indotti da queste inclusioni, dimostrando un effetto dose-dipendente dell’antibiotico geldanamicina (GA) sia nel prevenire l’aggregazione di PHOX2B che nel dissolvere gli aggregati pre-formati (14). Queste ed altre osservazioni suggeriscono una possibile attività terapeutica per questo farmaco, sebbene ulteriori studi siano indispensabili per confermare il suo effetto anche in vivo.

Le co-trasfezioni dei costrutti di PHOX2B caratterizzati dalle mutazioni frameshift con la regione regolatoria di DbH hanno mostrato un decremento progressivo di attività trascrizionale che sembra correlare con l’estensione della regione proteica di PHOX2B caratterizzata dal cambio del frame di lettura, suggerendo che la regione C-terminale anomala potrebbe modificare il ripiegamento di PHOX2B o alterarne il legame con altre proteine che cooperano alla regolazione trascrizionale di questo gene bersaglio. Diversamente, abbiamo osservato un aumento di 10-30% nella capacità delle proteine PHOX2B recanti le mutazioni frameshift di attivare la regione regolatoria di PHOX2A rispetto alla proteina wt (Figura 2A). Questo effetto potrebbe essere in relazione con il ruolo che PHOX2A e PHOX2B svolgono nella differenziazione dei neuroni noradrenergici e con la loro reciproca regolazione, responsabile della vasta sovrapposizione spazio-temporale dell’espressione delle due proteine. Inoltre, l’identificazione di mutazioni frameshift e missense di PHOX2B in gruppi specifici di pazienti affetti da neuroblastoma (NB), insieme alla loro associazione con pazienti CCHS predisposti allo sviluppo di tumori del sistema nervoso simpatico, ha suggerito un ruolo oncogenetico di PHOX2B che potrebbe essere mediato dall’effetto delle sue mutazioni frameshift sull’attivazione trascrizionale di PHOX2A. D’altra parte, a differenza delle proteine PHOX2B caratterizzate da una espansione nel tratto di polialanine, mutazioni frameshift non hanno dimostrato alcun effetto nella traslocazione della proteina PHOX2B nel nucleo, né alcuna ritenzione nel compartimento citoplasmatico, confermando l’esistenza di un diverso meccanismo patogenetico.

Origine parentale e mosaicismo somatico in CCHS

Espansioni di tratti di poli-alanina sono stati descritti anche a carico di altri fattori di trascrizione ed associati a diversi disordini congeniti dello sviluppo che includono ritardo mentale, malformazioni cerebrali e scheletriche. A differenza delle espansioni di poli-glutammina, le ripetizioni di residui di alanina risultano eterogenee (codificate da diversi codoni), scarsamente polimorfiche e stabili poichè, come osservato in ogni famiglia CCHS da noi analizzata, l’espansione rimane identica durante la trasmissione dal genitore portatore al figlio affetto (15).

Nonostante i casi in cui la mutazione risulta ereditata (circa 10%), la maggior parte delle mutazioni nel gene PHOX2B associate a CCHS si presenta de novo.Dal momento che le mutazioni de novo possono avvenire sia nella linea germinale parentale (materna o paterna) o a qualunque stadio dello sviluppo embrionale causando mosaicismo somatico, un’analisi quantitativa degli alleli “wild-type” e mutati ha permesso di dimostrare che, mentre non vi sono casi di mosaicismo somatico tra i pazienti, questi sono presenti tra i genitori portatori asintomatici. Questa osservazione può avere un’importante ricaduta nella consulenza genetica alle famiglie CCHS in quanto la presenza di mosaicismo somatico, fortemente indicativa di mosaicismo germinale, suggerisce l’opportunità del ricorso alla diagnosi prenatale, in coppie di genitori con un figlio affetto da CCHS, anche ove i genitori siano apparentemente non portatori (15).

Per quanto riguarda, invece, le mutazioni de novo originatesi nella linea germinale , analizzando la co-segregazione delle espansioni di poli-alanina con opportuni marcatori intragenici (SNP) in un gruppo di famiglie informative, abbiamo potuto definire che non vi è un’origine parentale preferenziale della mutazione più frequente del gene PHOX2B, che infatti è risultata essere avvenuta nel 35% degli alleli materni e nel 65% degli alleli paterni. Diversamente da quanto riportato per altri disordini associati ad espansioni di trinucleotidi, l’origine delle espansioni di poli-alanina sembra dunque essere indipendente da processi specifici della spermatogenesi o dell’oogenesi (15).

Casi CCHS adulti

Sebbene CCHS abbia una tipica presentazione neonatale, in letteratura sono stati riportati adulti con evidenze di ipoventilazione alveolare notturna, ciascuno eterozigote per un’espansione di +5Ala del gene PHOX2B (16). In tutti i casi sono riferiti sintomi già dall’infanzia, incluse “epilessie” associate a normale EEG e resistenti ai farmaci, episodi di cianosi ed apnea e l’abilità a trattenere il respiro per periodi prolungati, ma ciò nonostante essi hanno raggiunto l’età adulta senza il ricorso al supporto ventilatorio. Questi adulti presentano la più lieve delle mutazioni PHOX2B associate a CCHS, ed alcuni di essi hanno figli affetti la cui condizione ha generalmente favorito la diagnosi nel genitore apparentemente sano. Queste osservazioni confermano la penetranza completa e l’espressività estremamente variabile associate alla espansione “germline” di 5 residui alanina del gene PHOX2B: sebbene con esordio ritardato (“late-onset”) o con diagnosi ritardata (apparente presentazione adulta), la suddetta mutazione segna la soglia dalla quale l’allungamento del tratto di 20 polialanine dell’esone 3 di PHOX2B diviene sintomatico, associandosi alla manifestazione più lieve di malattia. La penetranza è (apparentemente) incompleta in quei casi che risultano con mutazioni a mosaico, insorte nella linea somatica in una fase avanzata dello sviluppo embrionale.

Complessivamente, queste osservazioni suggeriscono la probabile esistenza di altri adulti con CCHS non diagnosticata, di cui urge il riconoscimento alla luce di un loro adeguato trattamento ed in vista del rischio di trasmissione della malattia alla loro progenie.

Conclusioni

La definizione delle cause molecolari di CCHS ha permesso negli ultimi anni lo sviluppo di una adeguata diagnostica molecolare e di una efficace consulenza alle famiglie e, in alcuni casi, ha fornito l’indicazione per l’effettuazione di ulteriori accertamenti clinici. Inoltre, una serie di approcci molecolari ha permesso di far luce su alcuni aspetti della biologia di PHOX2B e di suoi specifici difetti, aprendo la strada ad ulteriori approfondimenti sui meccanismi patogenetici delle mutazioni CCHS e sulle possibili strategie terapeutiche. Ciò nonostante, ad oggi permangono fronti aperti e quesiti irrisolti che richiederanno ulteriori studi, tra i quali ad esempio: i) la maggior parte dei geni bersaglio attraverso i quali la forma selvatica di PHOX2B e sue forme mutate esercitano il loro effetto sono attualmente sconosciuti; ii) la caratterizzazione dei meccanismi molecolari innescati dalle mutazioni frameshift e missenso di PHOX2B indicherà nuove vie per comprendere le cause, ed intravedere targets di trattamento, dei tumori infantili del sistema nervoso simpatico.

Ringraziamenti

Ci e’ gradita l’occasione per ringraziare la Dott.ssa Isabella Ceccherini per la gentile concessione del presente materiale.