Documento ufficiale dell’ATS di normativa clinica: Ipoventilazione centrale congenita

Basi Genetiche, Diagnosi e Gestione.

Debra E. Weese-Mayer, Elizabeth M. Berry-Kravis, Isabella Ceccherini, Thomas G. Keens, Darius A. Loghmanee, and Ha Trang, on behalf of the ATS Congenital Central Hypoventilation Syndrome Subcommittee

THIS OFFICIAL CLINICAL POLICY STATEMENT OF THE AMERICAN THORACIC SOCIETY (ATS) WAS APPROVED BY THE ATS BOARD OF DIRECTORS SEPTEMBER 2009.

Premessa:

La Sindrome da Ipoventilazione Centrale Congenita (CCHS) è caratterizzata da ipoventilazione alveolare e disregolazione autonomica.

Obiettivi:

(1) Dimostrare l’importanza di testare PHOX-2B nella diagnosi e nel trattamento dei pazienti affetti da CCHS, (2) riassumere le recenti acquisizioni sulla comprensione di come le mutazioni del gene PHOX-2B portino al fenotipo CCHS , e (3) aggiornare le raccomandazioni per la diagnosi ed il trattamento dei pazienti affetti da CCHS.

Metodi:

I membri del comitato sono stati convocati sulla base della loro esperienza nell’ambito della CCHS ed è stato loro richiesto di riesaminare l’attuale stato delle conoscenze attraverso una revisione della letteratura effettuata indipendentemente gli uni dagli altri.
Il consenso sulle raccomandazioni è stato raggiunto attraverso l’accordo tra i membri del Comitato.

Risultati:

La revisione della letteratura sull’argomento ha consentito di elaborare un documento che riassume le più recenti acquisizioni nella comprensione della CCHS e la valutazione degli esperti riguardo alle evidenze relative alla gestione dei pazienti.

Conclusioni:

Per la diagnosi di CCHS è necessario dimostrare la mutazione di PHOX-2B. La conoscenza della mutazione specifica di PHOX-2B consente di prevedere la gravità del fenotipo CCHS. I genitori ed i pazienti affetti da CCHS dovrebbero essere testati per la mutazione PHOX-2B. Mantenendo alto il livello di attenzione nei casi di ipoventilazione alveolare inspiegate, si potrà verosimilmente evidenziare una maggiore incidenza di casi meno gravi di CCHS. Le raccomandazioni relative alla gestione clinica, volte ad ottenere la massima sicurezza per il paziente e la migliore prognosi neuroevolutiva comprendono:

(1) una valutazione generale in ospedale, due volte all’anno il primo anno e successivamente una volta all’anno, che comprenda: (i) studi fisiologici durante la veglia ed il sonno per valutare la funzionalità ventilatoria a vari livelli di attività e concentrazione, in tutte le fasi del sonno, in respiro spontaneo, durante la ventilazione artificiale durante la veglia ed il sonno e la risposta a stimoli fisiologici durante la veglia ed il sonno, (ii) monitoraggio Holter per 72 ore, (i i i) ecocardiografia, (iv) valutazione del grado di compromissione del SNA attraverso lo studio degli organi ed appararti che lo compongono, e (v) valutazione neurocomportamentale; (2) esame radiologico con bario manometria e/o biopsia rettale a tutto spessore nei pazienti con storia di stipsi; e (3) indagini mirate per i tumori della cresta neurale nei pazienti che, sulla base della mutazione PHOX-2B, risultano essere a maggior rischio.

Parole chiave: controllo respiratorio; disregolazione autonomica

Indice:

Generalità

Metodi

Obiettivi

Premesse storiche e Informazioni Generali sulla CCHS

PHOX-2B: Il gene implicato nella CCHS

Le mutazioni PHOX-2B nella CCHS

Genotipo PHOX-2B/Fenotipo CCHS

CCHS: non solo nei bambini

Il mosaicismo in un sottogruppo di genitori di bambini con CCHS

L’ereditarietà nella CCHS e la mutazione PHOX-2B

Il meccanismo delle PARMs

Il meccanismo attraverso il quale le mutazioni del gene PHOX-2B portano al fenotipo CCHS

Aspetti clinici della CCHS

Gestione ventilatoria

Abuso di alcol e droga

Un modello di medicina Transizionale e Translazionale del Sistema Nervoso Autonomo

Riassunto del documento

Indirizzi futuri
Generalità:

Nel 1999 l’American Toracic Society pubblicò il prìmo documento sulla Sindrome da Ipoventilazione Centrale Congenita (CCHS) (1). Da quel momento il mondo della CCHS è esploso con (1) la scoperta che il gene paired-like homeobox 2B (PHOX-2B) è il gene che determina la CCHS (2-5); (2) l’identificazione di una trasmissione ereditaria di tipo autosomico dominante (3,5-7); (3) la dimostrazione che la correlazione genotipo PHOX-2B-fenotipo CCHS condiziona la dipendenza dalla ventilazione artificiale (3,5), i dismorfismi facciali (8), le asistolie cardiache (9), il morbo di Hirschsprung ed il neuroblastoma (6,7); (4) l’identificazione di mutazioni PHOX-2B in adulti ed in bambini più grandi con CCHS (10-17) la cui diagnosi era stata misconosciuta o non sospettata nel periodo neonatale, nell’infanzia o in età pediatrica; (5) dimostrazione del mosaicismo nel 5-10% dei genitori di bambini affetti da CCHS (3,6); e (6) ampliamento delle conoscenze sullo specifico meccanismo attraverso il quale PHOX-2B porta al fenotipo CCHS (6,18-21). Lo scopo di un nuovo documento ATS sulla CCHS è quello di aiutare i clinici ad ottimizzare le cure per i pazienti, che potranno essere personalizzate sulla base della conoscenza della specifica mutazione genotipica PHOX-2B, e ad effettuare un counseling genetico. Infine, tutte le azioni relative alla gestione clinica saranno indirizzate su obiettivi a lungo termine incentrati sul miglioramento della qualità della vita dei pazienti con mutazione PHOX-2B confermata ed affetti da CCHS e su una migliore comprensione della funzionalità del sistema nervoso autonomo (SNA) in condizioni di salute o patologiche. Queste comprendono (1) una valutazione generale in ospedale, due volte all’anno il primo anno e successivamente una volta all’anno, che comprenda: (i) studi fisiologici durante la veglia ed il sonno per valutare il fabbisogno la funzionalità ventilatoria a vari livelli di attività e concentrazione, in tutte le fasi del sonno, in respiro spontaneo, durante la ventilazione artificiale durante la veglia ed il sonno e la risposta a stimoli fisiologici durante la veglia ed il sonno, (ii) monitoraggio Holter per 72 ore, (i i i) ecocardiografia, (iv) valutazione del grado di compromissione del SNA attraverso lo studio degli organi ed appararti che lo compongono, e (v) valutazione neurocomportamentale; (2) esame radiologico con bario manometria e/o biopsia rettale a tutto spessore nei pazienti con storia di stipsi; e (3) indagini mirate per i tumori della cresta neurale nei pazienti che, sulla base della mutazione PHOX-2B, risultano essere a maggior rischio.

Metodi

I membri del comitato sono stati convocati sulla base della loro competenza in ambito clinico, della ricerca clinica o della ricerca di base. La scelta è stata fatta nell’ambito sia della pediatria che della medicina dell’adulto. Il fine è stato quello di ottenere una rappresentanza internazionale. Ai membri del comitato è stato richiesto di esaminare l’attuale stato delle conoscenze effettuando indipendentemente una ricerca della letteratura disponibile su Pub Med e OVID. A ciascun membro è stato chiesto di valutare la letteratura selezionata, effettuare una valutazione critica degli articoli e quantificare l’importanza dei singoli articoli. Gli articoli più quotati e le osservazioni critiche sono stati incorporati in un documento di lavoro. Tra i membri del Comitato è stato raggiunto il consenso sulle raccomandazioni.

Obiettivi

1. Rendere noto ai curanti, ai genitori, a coloro che si occupano dei pazienti, e agli operatori sanitari che la mutazione di PHOX-2B è un requisito necessario per confermare la diagnosi.
2. 2. Ampliare le conoscenze comuni su PHOX-2B come gene implicato nella CCHS. Il lettore potrà apprendere che (i) circa il 90% degli individui con fenotipo CCHS sono eterozigoti per un’espansione (repeat mutation) della polialanina nel gene

PHOX-2B , (ii) circa il 10% degli individui affetti da CCHS sono eterozigoti per una mutazione missense, nonsense o frameshift del gene PHOX-2B (iii) se non viene trovata la mutazione PHOX-2B dovrebbero essere prese in considerazione diagnosi alternative alla CCHS.

1. Affermare che esiste la possibilità di prevedere il fenotipo CCHS sulla base della mutazione del genotipo PHOX-2B
2. Rendere noto ai clinici che la CCHS non viene più diagnosticata solo in epoca neonatale dato che è descritta anche dopo il primo anno di vita, nei bambini più grandi e nell’adulto.
3. Focalizzare l’attenzione sulla trasmissione autosomica dominante della mutazione PHOX-2B, di mosaicismo nel 5-10% dei genitori e sull’importanza del test genetico di entrambi i genitori dei pazienti affetti da CCHS.
4. Ampliare le conoscenze sugli specifici meccanismi attraverso i quali PHOX-2B determina il fenotipo CCHS.
5. Aggiornare le informazioni sui trattamenti disponibili e sulle cure domiciliari.
6. Divulgare il fatto che la CCHS rappresenta un modello di medicina transizionale e translazionale del sistema nervoso autonomo. Oltre ad usare la mutazione genetica PHOX-2B al fine di ottimizzare le cure dei pazienti, è necessario che i clinici continuino a prendersi cura di questi particolari pazienti anche quando raggiungono l’età adulta.

Il documento

Cenni storici e Informazioni generali sulla CCHS

La CCHS è stata descritta per la prima volta nel 1970 da Robert Mellins e collaboratori (22). Nonostante numerosi case reports, casistiche ampie non sono state pubblicate fino al 1992 (23). Nel documento dell’ATS del 1999 si stimava che” approssimativamente ci sono circa 160-180 bambini affetti da CCHS nel mondo” ma si precisava che questi numeri “ devono essere considerati una sottostima” (1). Nel 2009 l’insieme dei laboratori degli Stati Uniti, Francia, Italia, Giappone, Germania, Taiwan, Cina, Olanda, Cile, Regno Unito e Australia hanno attualmente diagnosticato circa 1000 casi di CCHS portatori della mutazione PHOX-2B. Anche questa sembra essere una sottostima, dato che individui con fenotipi meno compromessi non vengono diagnosticati. Sebbene la CCHS venga diagnosticata caratteristicamente in epoca neonatale, recenti segnalazioni riportano che i pazienti possono essere diagnosticati durante l’infanzia ( 5,6,17,24-26) o da adulti ( 10-17,26), a seconda del genotipo PHOX-2B e del grado di attenzione del paziente, della famiglia e dei curanti. Indipendentemente dall’età di comparsa , i soggetti affetti da CCHS saranno diagnosticati clinicamente a causa dell’assenza di patologie primitivamente polmonari, cardiache, o neuromuscolari o di alterazioni troncoencefaliche definite che possano giustificare tutta l’espressione fenotipica ivi inclusa la Disregolazione del Sistema Nervoso Autonomo (DSNA). I soggetti affetti da CCHS caratteristicamente presentano riduzione del volume corrente e scarsa variabilità della frequenza respiratoria durante la veglia ed il sonno (1), sebbene l’ipoventilazione alveolare più grave avvenga fondamentalmente durante il sonno. A causa dell’ipoventilazione questi soggetti diventano ipossiemici ed ipercapnici ma ,caratteristicamente, non manifestano la risposta a queste stimolazioni endogene sotto forma di incremento della ventilazione ed arousal durante il sonno, e non percepiscono l’asfissia durante la fase di veglia e in assenza di movimento (1). Condizioni associate alla CCHS che riflettono una DSNA su base anatomica comprendono la Malattia di Hirschsprung (HSCR) e i tumori della cresta neurale oltre ad una serie di sintomi compatibili con una DSNA su base fisiologica, caratterizzata da ridotta risposta pupillare alla luce, alterazioni della motilità esofagea, spasmi affettivi, ridotta temperatura corporea basale, sporadiche fasi di sudorazione, mancanza di percezione della dispnea, alterata percezione dell’ansia, e mancata risposta fisiologica all’esercizio fisico ed agli stress ambientali (1, 23, 27-39). La CCHS è una malattia che dura tutta la vita, che solleva questi interrogativi cruciali: (1) il fenotipo può cambiare con l’età sulla base della mutazione PHOX-2B, l’età della diagnosi e l’adeguatezza della gestione del caso? e (2) le strategie di intervento saranno efficaci in considerazione della natura della mutazione e del tempo della sua comparsa riferito allo sviluppo embriologico?.

Dato che lo scopo di questo documento non è quello di fornire una review esauriente sulla CCHS, il lettore può fare riferimento a recenti reviews. (ww.genereviews.org e Riferimenti bibliografici 40 e 41).

PHOX2B: Il gene che definisce la malattia

Il sospetto di una familiarità nei casi di CCHS è emerso negli anni tra il 1980 ed il 2001. I dati sulla ricorrenza familiare sono rappresentati da segnalazioni di casi di gemelle monozigoti (42), sorelle (43), fratelli o sorelle successivi (23,44), fratelli o sorelle di genitori differenti (45), con CCHS. Nell’era pre-PHOX2B/CCHS, cinque donne cui era stata diagnosticata una CCHS in età pediatrica. hanno partorito due bambini con CCHS, uno di questi probabilmente affetto da CCHS mascherata da una grave immaturità e displasia broncopolmonare, ed uno con CCHS ad insorgenza tardiva (46,47). Un report relativo ad un bambino con CCHS nato da madre affetta da neuroblastoma infantile (48), aggiunse una prova al sospetto di trasmissione genetica nello spettro fenotipico delle ANSD e della CCHS. Inoltre, le ANSD sono state studiate con uno studio caso- controllo (27, 28), da cui sono emerse evidenze importanti che hanno confermato le basi genetiche della CCHS, la quale è stata pertanto considerata come la manifestazione più severa di ANSD (1, 27, 44), anche se il ruolo di PHOX2B nell’insieme delle ANSD rimane sconosciuto.

Studi più recenti sulle basi genetiche della CCHS, si sono limitati ad indagare geni noti per la loro correlazione con HSCR. Sono stati riportati venti pazienti con mutazioni strutturali, ossia alteranti la proteina, dei geni codificanti il recettore tirosin chinasico RET (49–53), il “glial cell–derived neurotrophic factor” (GDNF) (49), l’endotelina 3 (EDN3) (52, 54), il “brain-derived neurotrophic factor”(BDNF) (55), lo”human aschaete-scute homolog” (HASH1) (4, 56), il “paired-like homeobox gene 2A” (PHOX2A) (4), il GFRA1(4), il “bone morphogenic protein 2” (BMP2) (3), e l’”endothelin converting enzyme 1” (ECE1) (3). Altri tre reports hanno evidenziato l’assenza di mutazioni di RET (57) e di mutazioni a carico di RNX (58, 59).

Nel 2003 PHOX2B è stato individuato come il gene determinante la CCHS (2,3). PHOX2B codifica per un fattore di trascrizione altamente conservato, che riveste un ruolo cruciale nello sviluppo di circuiti riflessi del SNA nel topo (60, 61). PHOX2B contiene sequenze ripetute di 20 alanine nell’esone 3, che Amiel e coll. dimostrarono contenere una serie di duplicazioni da 15 a 27 nucleotidi, determinanti l’espansione di un tratto ripetuto di 25 -29 alanine presenti sull’allele dei soggetti con CCHS in 18 dei 29 (62%) casi Francesi (2). Tali espansioni sembrarono essere de–novo, dal momento che non erano presenti in otto coppie di genitori di casi di CCHS. Due casi di CCHS su 29 (7%) presentavano una mutazione frameshift. Per cui, il 69% dei 29 pazienti Francesi risultarono eterozigoti per mutazioni di PHOX2B. Amiel e colleghi (2) dimostrarono inoltre, l’espressione precoce di PHOX2B sia nei circuiti neuronali centrali del sistema autonomo, sia nelle strutture periferiche derivate dalla cresta neurale.

In accordo con gli studi francesi, Weese- Meyer e coll. (3) hanno analizzato i geni coinvolti nello sviluppo embriologico del SNA (mammalian aschaete-scute homolog-1 [MASH1],BMP2, engrailed-1 [EN1], TLX3, ECE1, endothelin-1 [EDN1],e PHOX2A). Tuttavia, pur non scoprendo nuove mutazioni responsabili di malattia in nessuno di questi geni, in una coorte di 67 casi di CCHS, Weese-Meyer e coll. (3) hanno identificato delle espansioni di tratti ripetuti, in eterozigoti sull’esone 3 del PHOX2B, in 65 su 67 (97%) bambini con fenotipo CCHS. Nei restanti due casi è stata identificata, in un paziente una mutazione non-sense di PHOX2B (codone di stop prematuro), nell’altro è stata trovata, solo più tardi, una repeat expansion di polialanine in PHOX2B, dopo che è stato risolto un problema di scambio del campione nel laboratorio di origine. (7). Complessivamente Weese-Mayer e colleghi (3) hanno identificato mutazioni nell’esone 3 del gene PHOX2B nel 100% dei 67 bambini con fenotipo CCHS, indicando PHOX2B come il gene che determina la malattia nella CCHS.

Nessuna delle mutazioni di PHOX2B era presente nei 67 controlli confrontati per sesso ed etnia. Questo studio ha rilevato inoltre: 1)un’associazione tra la lunghezza del tratto di polialanina e la gravità della disfunzione autonomica.; 2) mosaicismi in 4 di 97 genitori di pazienti CCHS, che suggeriscono che non tutte le mutazioni di PHOX2B si verificano de- novo; 3) una trasmissione autosomica dominante della mutazione di PHOX2B e del fenotipo CCHS nei casi di CCHS; e 4) una trasmissione autosomica dominante della mutazione di PHOX2B da genitori con mosaicismi. Inoltre, questi autori (3), hanno introdotto il primo saggio clinicamente valido per la diagnosi di CCHS, utilizzando un campione e un metodo accurato per studiare e sequenziare le sequenze ripetute associate con il tratto di polialanina (patented; Rush University Medical Center, Chicago, IL; patent donated to charitable trust and proceeds from PHOX2B Screening Test support CCHS research), che possono essere utilizzati nella diagnosi prenatale, test di familiarità, e test di diagnosi in individui sintomatici.

Successivamente agli studi precedenti, espansioni ripetute di polialanina di PHOX2B sono state riscontrate in 4 (40%) e una mutazione frameshift in 1 (10%) di 10 casi di CCHS in Giappone (4). In due casi tali espansioni risultarono de-novo. Sasaki e colleghi (4) hanno utilizzato la stessa metodologia dei Francesi (2), mancando l’individuazione della mutazione del gene PHOX2B nel 50% dei casimutazione, come poi riportato nel 2005 (62). Nel 2004, Matera e colleghi (5) hanno identificato una mutazione di PHOX2B eterozigote per espansione del tratto di polialanina ripetuto da 25 a 33 nucleotidi in 21 casi (88%) ed una mutazione frameshift eterozigote in 2 (8%) su 24 casi di CCHS reclutati in Italia, Germania e Paesi Bassi. Questo studio ha confermato la correlazione tra la dimensione della sequenza espansa di PHOX2B, la severità del fenotipo respiratorio e la sintomatologia associata (3). Matera e coll. hanno dimostrato inoltre che le sequenze alleliche espanse, soprattutto quelle con un numero variabile da 30 a 33 alanine, potevano rimanere misconosciute alla PCR (polymerase- chain –reaction) a causa della regione estremamente ricca in nucleotidi GC nel tratto di polialanine del gene PHOX2B; pertanto la frequenza di mutazioni PHOX2B poteva essere sottostimata a causa della diminuita presenza dell’allele più lungo (espanso) nel prodotto dell’amplificazione, che favorisce normalmente l’allele più corto (normale). Utilizzando una metodica per amplificare le regioni GC-rich, Trang e colleghi (63) hanno rianalizzato 34 pazienti Francesi ed identificato una mutazione di PHOX2B nel 91% dei casi, mentre Trochet e colleghi (6) hanno individuato mutazioni di PHOX2B nel 93% di 174 pazienti con CCHS di diverse nazionalità, includendo 7 dei 9 pazienti riportati da Amiel e coll. come “ mutazione-negativi” nel 2003 (2). Berry-Kravis e coll. (7) e Weese-Mayer e coll. (64) hanno individuato mutazioni di PHOX2B in 184 soggetti (nel 2006) e più di 350 soggetti con CCHS (nel 2008) rispettivamente, (con una sensibilità e specificità del test pari al 100%) con una cohorte principalmente costituita da casi reclutati dagli Stati Uniti e un 10% di pazienti provenienti da altri Paesi.

Come riassunto precedentemente (40, 41) (www.genereviews.org), il range di ripetizioni nucleotidiche di polialanina dell’allele mutato di PHOX2B dei pazienti con CCHS va da 24 a 33 (2–7, 13, 15–17, 25, 26, 65–70). Mutazioni da espansione di ripetizioni di polialanina (PARMs) non sono state riscontrate nei 482 controlli delle sopra-citate pubblicazioni, né tra i 1520 individui sani studiati a Taiwan (67). Le varianti caratterizzate da contrazioni dello stesso tratto di polialanina ( con 7, 13, 14, o 15 ripetizioni di residui alanina rispetto ai 20 che si trovano normalmente) sono state riportate in tre casi di CCHS (3, 7, 71), comprendere portatori anche di una PARM oppure una “nonpolyalanine repeat mutation” (NPARM), ma che sono state ritrovate anche nel 3% circa dei controlli apparentemente sani (2, 3, 5, 72, 73), in genitori di pazienti CCHS (3,16,71), e in un piccolo gruppo di pazienti con vaghi sintomi suggestivi di disregolazione autonomica e/o ipoventilazione sporadica, oppure con “apparent life-threatening events” (ALTE) ma senza il corredo sintomatologico delle CCHS (71). Mutazioni PARMs che correlano con sintomi di malattia sono state osservate in 9 pazienti su 16 con mutazioni casuali diRET, GDNF, BDNF, HASH1, e GFRA1, il che indica che PHOX2B rappresenta il gene che definisce la malattia.

Mutazioni del gene PHOX2B nella CCHS

La mutazione del gene PHOX2B è il requisito per la diagnosi di CCHS. Oltre il 90% dei casi CCHS sono eterozigoti per una mutazione PARM codificante un tratto di lunghezza compresa tra 24 e 33 alanine a cui corrispondono genotipi da 20/24 a 20/33 (il genotipo normale è 20/20). Il rimanente 10% circa dei pazienti con un fenotipo CCHS classico risulta essere eterozigote per una NPARM (mutazioni missenso, nonsenso e frameshift) del gene PHOX2B (74). I genotipi 20/25, 20/26 e 20/27 sono i più comuni nonostante un crescente numero di mutazioni meno comuni siano correntemente rilevate (vedi istogramma di tutti i dati pubblicati e dei dati recenti ottenuti dagli autori alla fine del 2009 in Figura 1).

Figura1. Numero di ripetizioni di polialanine di PHOX2B per ogni genotipo. Questi dati rappresentano tutta la letteratura pubblicata sull’argomento oltre ai dati in corso forniti dagli autori sia sulle PARMs che sulle NPARMs. I genotipi più comuni sono 20/25, 20/26 e 20/27. Adattata dalla Referenza 41.

Mutazioni NPARMs (74) sono state riportate in associazione con CCHS negli Stati Uniti (3, 7, 20, 41, 64), Italia (5, 16, 18), Giappone (4), Francia (2, 6, 13, 75), Germania (50, 69, 76), Australia (77), Paesi Bassi (78), Cina (79) e Taiwan (67, 80).

Ad oggi, al mondo sono stati descritti 76 individui con CCHS e mutazioni NPARMs del gene PHOX2B; queste mutazioni includono preferenzialmente mutazioni frameshift (59/76, 78%), nonsenso (3/76, 4%), missenso (12/76, 16%), e missenso che eliminano il codone di stop (2/76, 3%) (vedi Figura 2 per uno schema di tutti i dati pubblicati e dei dati osservati dagli autori). La maggior parte delle NPARMs associate a CCHS sono state trovate alla fine dell’esone 2 o nell’esone 3 (Figura 2).

La maggior parte delle mutazioni NPARMs insorge de novo e produce un fenotipo grave con presenza di HSCR e un esteso coinvolgimento dell’intestino, necessità di un supporto ventilatorio continuo ed un incremento del rischio di tumore nei pazienti maggiori di 1 anno di età (6, 7). Quindi, la presenza di HSCR esteso e di CCHS è fortemente suggestivo della presenza di una mutazione NPARM nel paziente. Le delezioni ricorrenti di 38 e 35 bp, che causano frameshift del tratto di polialanine (PA) nella proteina, producono un fenotipo molto grave, e sono state identificate in differenti Paesi da numerosi gruppi. Un numero esiguo di NPARMs sono associate ad un’alta incidenza di HSCR ma a un fenotipo CCHS più lieve e penetranza incompleta in almeno 3 famiglie (7). Alcune mutazioni frameshift localizzate nella stessa regione (618delC, 577delG) sono state ereditate e hanno una penetranza variabile nelle famiglie (5, 7), suggerendo che le mutazioni frameshift che eliminano un nucleotide (-1) in questa regione possono essere associate ad un fenotipo più lieve rispetto ad altre mutazioni frameshift. Le mutazioni c.422G>A e c.428A>G tradotte a livello proteico rispettivamente in p.R141Q e p.Q143R sono state osservate in numerosi casi di CCHS non correlati e insieme alla mutazione c.299G>T (p.R100L) (20) sono le uniche mutazioni missenso identificate in CCHS. La mutazione c.419C>A (p.A140E) è stata recentemente riportata in casi di CCHS ad insorgenza tardiva (later-onset) sia isolati che associati a HSCR (13, 81).
Figura 2. Schema del gene PHOX2B con indicati i siti delle mutazioni associate a CCHS. Tutte le ripetizioni di polialanine (PARMs) sono localizzate nel secondo tratto dell’esone 3; quasi tutte le NPARMs identificate ad oggi sono nella regione terminale dell’esone 2 o all’interno dell’esone 3. Questi dati rappresentano tutta la letteratura pubblicata sull’argomento oltre ai dati in corso forniti dagli autori. Adattata dalla Referenza 41.

Correlazione genotipo/fenotipo nella CCHS

Nonostante l’identificazione nel 2003 di PHOX2B quale gene causativo di CCHS, le riviste continuano a pubblicare studi privi 1) della diagnosi molecolare di CCHS, 2) di una distinzione nell’analisi dei dati tra i soggetti CCHS con mutazioni e soggetti con altre cause di ipoventilazione, e 3) della correlazione genotipo/fenotipo. Dato il ruolo cruciale di PHOX2B nello sviluppo del sistema nervoso autonomo (SNA) è opportuno ipotizzare una relazione tra il genotipo di PHOX2B e i seguenti aspetti del fenotipo CCHS:

Figura3. Percentuale di casi che necessitano di ventilazione continua, presenza di malattia di Hirschsprung e tumori di origine dalle creste neurali nei CCHS con espansioni di polialanine (PARMs) rispetto ai CCHS con mutazioni non-polialanine (PARMs) nel gene PHOX2B. I casi CCHS mostrati in questa figura comprendono tutti i casi riportati in letteratura, inclusi i dati da Stati Uniti, Italia, Francia, Giappone, Germania, Taiwan, Cina, Australia e Paesi Bassi oltre ai dati in corso riportati dagli autori laddove era disponibile una valutazione clinica. I dati inerenti i tumori delle creste neurali sono stati ottenuti da casi le cui informazioni erano disponibili e il bambino era sopravvissuto fino al primo anno di età. Tutti i casi PARMs con tumori hanno larghe espansioni di polialanine (29-33 ripetizioni). Adattata dalle Referenze 7 e 41.

Dipendenza dalla ventilazione continua – Esiste una relazione tra il genotipo PARMs e la necessità di una ventilazione assistita (3, 5, 7, 65). In particolare, individui con il genotipo 20/25 raramente richiedono un supporto ventilatorio 24 ore al giorno; individui con il genotipo 20/26 hanno durante la veglia necessità variabili in base al diverso livello di attività; individui con genotipo da 20/27 a 20/33 normalmente richiedono un supporto ventilatorio continuo. I casi later-onset con genotipo 20/24 o 20/25 (10, 11, 17) manifestano l’ipoventilazione meno severa, che si presenta dopo l’esposizione ad anestetici o a seguito di gravi infezioni respiratorie, e sono gestiti con il solo supporto ventilatorio notturno. Al contrario delle mutazioni PARMs, la maggior parte degli individui con difetti NPARMs richiedono un supporto ventilatorio continuo (7) (Figura 3).

La malattia di Hirschsprung – La malattia di Hirschsprung (HSCR), che sappiamo da tempo ricorrere nel 20% dei casi CCHS, è in prevalenza associata ai casi NPARMs. In particolare, HSCR è riportata nell’ 87%-100% dei casi con NPARMs e nel 13%-20% dei casi con PARMs (6, 7, 65) (vedi Figura 3 per l’istogramma di tutti i dati pubblicati e dei dati recenti ottenuti dagli autori). Tra i portatori di mutazioni PARMs, non sono stati riportati casi di HSCR in soggetti con genotipo 20/25, e solo raramente in soggetti con genotipo 20/26. Un’alta incidenza di HSCR in individui con genotipo 20/27 è stata riportata in un gruppo (6) ma non ancora definitivamente confermata in altri. Recenti studi inoltre suggeriscono che il gene RET abbia un ruolo importante come gene modificatore del fenotipo HSCR in pazienti CCHS (53, 82).

Tumori che originano dalle creste neurali – Questi tipi di tumori insorgono più frequentemente tra individui portatori di mutazioni NPARMs (50%) rispetto a individui portatori di mutazioni PARMs (1%) (6, 7, 65) (Figura 3) (tutti neuroblastomi). Tuttavia, ad oggi, tra le PARMs, solo nei soggetti con genotipo 20/29 e 20/33 (2, 3, 6, 7) sono stati identificati tumori derivanti dalle creste neurali (ganglioneuroma e ganglioneuroblastoma).

Asistolie– In un recente studio di Gronli e colleghi (9) è stata identificata una correlazione tra le più comuni mutazioni PARMs (20/25-20/27) e la lunghezza dell’intervallo R-R mediante monitoraggio Holter. In particolare, nessuno dei pazienti con genotipo 20/25 ha mostrato pause sinusali maggiori o uguali a 3 secondi mentre il 19% degli individui con genotipo 20/26 e l’83% degli individui 20/27 ha avuto pause maggiori o uguali a 3 secondi. In accordo a questa osservazione, i pacemaker cardiaci sono stati impiantati in nessun paziente con genotipo 20/25, nel 25% dei soggetti con genotipo 20/26 e nel 67% dei soggetti con genotipo 20/27. Tra i casi con genotipo 20/26 e 20/27 privi di pacemaker cardiaci, due sono deceduti e uno ha una grave compromissione neurocognitiva. Inoltre, sono stati osservati i seguenti casi: un adulto later-onset CCHS con genotipo 20/25 che manifesta pause maggiori o uguali a 8 secondi (11) e un altro caso later-onset CCHS con genotipo 20/25 con asistoli prolungate rilevate mediante monitoraggio Holter (caso non ancora pubblicato). Queste osservazioni suggeriscono che individui con genotipo 20/25 potrebbero non manifestare la patologia cardiaca durante l’infanzia ma, se non adeguatamente monitorati o prontamente diagnosticati, potrebbero manifestare asistolie in età adulta. Il rischio negli individui portatori di mutazioni NPARMs rimane non stimabile.

Sintomi associati a ANSD – Weese-Mayer e colleghi e Patwari e colleghi (3, 83) hanno dimostrato che esiste una correlazione tra il numero di ripetizioni nel tratto di alanine e il numero di sintomi di disregolazione del SNA (Figura 4). Sebbene queste misure di ANSD siano state estrapolate dall’analisi di dati medici, questionari compilati e valutazioni fisiologiche, esse non includono test specifici per la valutazione della funzione autonomica. Nonostante ciò, sia i medici che i genitori si dovrebbero aspettare più sintomi di ANSD tra i soggetti con genotipi da 20/27 a 20/33.

Dismorfismi facciali – Uno studio riportato da Todd e colleghi (8) ha descritto una caratteristica facies tra i bambini con CCHS di età compresa tra 2 anni e l’età dell’adolescenza e soprattutto tra i soggetti con mutazioni PARMs. I visi dei soggetti con CCHS erano generalmente più corti e piatti, e mostravano una tipica deviazione in basso del terzo laterale del labbro superiore. Sebbene non dismorfico, il viso è più corto di quanto sia largo, risultando nella caratteristica faccia a forma di “scatola” osservata nei CCHS. L’86% dei casi CCHS e l’82% dei controlli sono stati correttamente classificati usando cinque variabili per caratterizzare la facies (altezza del labbro superiore, spazio tra gli occhi, altezza della parte superiore del viso, protrusione della punta del naso, tratto labiale). Il numero limitato di casi con le maggiori espansioni di alanine (solo 5 casi con 30-33 ripetizioni) possono avere precluso l’identificazione di una correlazione significativa tra il numero di ripetizioni di polialanine e le caratteristiche del fenotipo facciale in CCHS.

Dermatoglifi – Todd e colleghi (84) hanno misurato la frequenza dei tipi di conformazione dei dermatoglifi, la simmetria sinistro/destro e la correlazione genotipo/fenotipo in CCHS. Le frequenze delle diverse conformazioni di dermatoglifi erano differenti tra CCHS e controlli: sono stati riportati un aumento degli archi nelle femmine e cappi nei maschi, con le maggiori differenze tra mano sinistra e mano destra negli individui con CCHS/HSCR. I punteggi relativi alle differenze tra i casi CCHS e CCHS/HSCR e tra tutte le femmine rispetto a tutti i maschi non sono risultati significativamente differenti.

Figura 4. Numero di casi di Sindrome da Ipoventilazione Centrale Congenita (CCHS) associati a sintomi di disregolazione del sistema nervoso autonomo (ANSD) rispetto al genotipo di PHOX2B tra 65 bambini affetti, portatori di un’espansione di polialanine (PARM). Il numero dei sintomi ANSD correla direttamente con il numero di alanine del tratto espanso. Alcuni pazienti presentano lo stesso numero di sintomi e identico genotipo per questo, osservando la figura, si ha l’impressione che vi sia un numero di punti minore rispetto ai casi. L’analisi del genotipo (che consiste nel confrontare i genotipi attraverso ANOVA) rivela un’associazione significativa tra la lunghezza del tratto espanso di polialanine e il numero di sintomi ANSD (F = 2.93, df = 5, P = 0.021). Adattata dalla Referenza 3.

CCHS: non solo in età neonatale

Il termine “congenita” quale usato storicamente in CCHS connotava una insorgenza nel periodo neonatale. Nonostante ciò, sono stati precedentemente descritti pazienti che hanno manifestato la patologia oltre l’età neonatale e quindi definiti later-onset (LO)-CCHS (5, 6, 10-17, 24-26, 85). Nel contesto di 1) un’aumentata conoscenza di CCHS, 2) la scoperta di PHOX2B quale gene causativo di CCHS e 3) la disponibilità di un test genetico per le mutazioni di PHOX2B, si è verificato un aumento nella tempestività della diagnosi di casi LO-CCHS.

LO-CCHS riflette la penetranza variabile di alcune mutazioni del gene PHOX2B che potrebbero necessitare di fattori ambientali per manifestare il fenotipo come i genotipi 20/24 e 20/25 e rare mutazioni NPARM. Un’analisi attenta della storia clinica dei casi con ipoventilazione alveolare dopo il periodo neonatale spesso dimostra segni e sintomi compatibili con una ipoventilazione precedente e altri disordini della regolazione autonomica dal periodo neonatale. La diagnosi di LO-CCHS dovrebbe essere presa in considerazione nei casi di ipoventilazione alveolare mediata dal sistema nervoso centrale e/o cianosi o convulsioni insorte dopo 1) l’uso di anestetici o antidepressivi del SNC, 2) gravi infezioni polmonari recenti o 3) trattamento di apnea ostruttiva durante il sonno. Con un consistente sospetto clinico di LO-CCHS, lo specialista può ottenere prontamente una diagnosi dall’analisi del gene PHOX2B, evitando quindi uno scompenso potenzialmente mortale, così come il rischio di compromissione neurocognitiva. La valutazione dei casi ad insorgenza tardiva richiede un’attenta analisi della storia clinica con particolare attenzione a precedenti esposizioni ad anestesie o sedazioni, o recuperi lenti da gravi malattie respiratorie, crisi non spiegabili/convulsioni o compromissione neurocognitiva. Inoltre, dovrebbero essere effettuati: l’analisi di fotografie frontali e laterali (per la valutazione di caratteristiche del viso compatibili con CCHS; i maschi adulti spesso hanno baffi che nascondono il tratto labiale), di ogni documentazione elettrocardiografica di pause sinusali prolungate (preferenzialmente ottenuta tramite monitoraggio Holter per 72 ore), di ogni valutazione fisiologica documentante la ventilazione durante la veglia e durante il sonno (per ipercapnia e ipossiemia), del livello di bicarbonato (per acidosi respiratoria compensata), o di radiografie del torace, ecocardiogramma, o elettrocardiogramma (per valutare la corretta dimensione delle cavità cardiache di destra o la presenza di ipertensione polmonare). Nei casi di costipazione, il clisma opaco o uno studio manometrico dovrebbero essere eseguiti per escludere la forma corta della malattia di Hirschprung. I pazienti diagnosticati dopo il periodo neonatale dovrebbero essere definiti LO-CCHS e, in base alla presenza di una mutazione del gene PHOX2B possono essere distinti da altre sindromi caratterizzate da lieve ipoventilazione alveolare.

Il genotipo 20/24 probabilmente risulta essere sottodiagnosticato a causa della ipoventilazione subclinica e per la necessità di interazione di cofattori ambientali (17) o della condizione di omozigosi per la manifestazione del fenotipo CCHS (66). L’analisi molecolare di PHOX2B in gruppi di individui caratterizzati da profonda ipoventilazione dopo anestesia, sedazione, o malattie respiratorie può identificare ulteriori pazienti con genotipo 20/24 e 20/25. In questo modo, altri fattori ambientali o genetici ancora non identificati, che potrebbero influenzare la penetranza variabile delle mutazioni 20/24 e 20/25, così come la più recentemente descritta nuova mutazione missenso (81), potrebbero essere determinati. E’ essenziale che gli esperti distinguano i LO-CCHS dall’obesità a insorgenza rapida con disfunzione ipotalamica, ipoventilazione e disregolazione autonomica (ROHHAD) (86), un raro disordine descritto per la prima volta nel 1965 (87). Originariamente chiamata sindrome da ipoventilazione centrale a insorgenza tardiva con disfunzione ipotalamica (88), è stata rinominata nel 2007 (86) per sensibilizzare i clinici verso la tipica sequenza di sintomi caratteristici. In quella stessa pubblicazione, Ize-Ludlow e colleghi hanno chiarito che ROHHAD è una sindrome diversa da CCHS, come dimostrato dalla storia clinica e dall’analisi di PHOX2B. Sebbene meno di 55 bambini con questo disordine siano stati descritti in letteratura (86, 88, 89), è essenziale riconoscere il fenotipo come distinto da CCHS. I bambini con ROHHAD tipicamente manifestano, tra l’età di 1,5 e 7 anni, obesità a rapida insorgenza (incremento di 9-18 Kg in 4-6 mesi), seguita da altri disordini ipotalamici tra i quali sbilancio idrico, elevati livelli di prolattina, alterata insorgenza della pubertà e altri. Circa la metà dei bambini manifesteranno un episodio di arresto cardio-respiratorio dopo un’infezione virale intercorrente, in seguito al quale l’apnea ostruttiva durante il sonno e l’ipoventilazione verranno rilevate. Inoltre potranno anche insorgere sintomi di disregolazione autonomica tra i quali bassa temperatura corporea, estremità fredde, severa bradicardia, minore percezione del dolore, e altri. In qualsiasi momento durante la manifestazione della malattia, il 40% degli affetti potrà sviluppare un tumore delle creste neurali spesso associato a scoliosi. Disordini di comportamento, strabismo e un’anomala risposta delle pupille sono stati riportati nei ROHHAD. Questi bambini possono essere supportati dalla maschera ventilatoria solo durante la notte, ma un piccolo gruppo di essi richiede ventilazione 24 al giorno mediante tracheostomia. Sebbene siano in corso studi su ROHHAD, la causa specifica per questo disordine non è stata ancora identificata. Siccome non c’è alcun test genetico disponibile per questo disordine, la diagnosi di ROHHAD è basata sulla presentazione clinica, le caratteristiche cliniche correlate e la documentata assenza di altre diagnosi potenzialmente confondenti, inclusa l’esclusione di CCHS mediante il test disponibile su PHOX2B (documentante assenza di PARMs e NPARMs).

Mosaicismo in un sottogruppo di genitori di bambini CCHS

La maggior parte delle espansioni di polialanine insorge de novo in CCHS, ma dal 5% al 10% sono ereditate da un genitore mosaico tipicamente non affetto. Una distinzione è necessaria tra l’eredità germinale e l’insorgenza somatica delle mutazioni di PHOX2B. La penetranza incompleta è stata dimostrata quando alcune mutazioni di PHOX2B sono presenti in tutte le cellule (incluse le cellule riproduttive della linea germinale) di individui noti come non affetti. Queste ultime mutazioni di PHOX2B (20/24, 20/25, e qualche NPARMs), anche se asintomatiche in alcuni individui, possono essere caratterizzate da lievi o variabili effetti fenotipici rispettivamente nei bambini affetti da CCHS o altri membri della famiglia (3, 5, 17). Al contrario, il mosaicismo somatico, dovuto a mutazioni post-zigotiche, è stato riportato in un sottogruppo di genitori di casi CCHS tipici caratterizzati da espansioni di polialanine più lunghe di 25 ripetizioni e da NPARMs (3, 6,7 ,16).

Il mosaicismo somatico per una PARM è stato descritto per la prima volta da Weese-Mayer e colleghi (3) in 4 genitori delle 54 famiglie disponibili (7,4%). Nel 2005 Trochet e colleghi (6) hanno identificato il mosaicismo somatico in uno di 10 genitori di pazienti CCHS, confermando che generalmente il 10% di bambini affetti da CCHS avrà ereditato la mutazione da un genitore mosaico. In entrambi gli studi il mosaicismo è stato rilevato nel DNA estratto dai leucociti periferici dei genitori mediante l’osservazione di un segnale prodotto dall’allele espanso che risulta più debole di quello dell’allele normale.

Una stima quantitativa del mosaicismo somatico in genitori non affetti è stata recentemente effettuata in altri 2 studi. Il prodotto dell’amplificazione del DNA ottenuto da portatori asintomatici delle espansioni di alanine comprese tra 20/25 e 20/31 è stato caricato su un sequenziatore automatico e gli alleli normali ed espansi sono stati visualizzati (Figura 5) come picchi la cui area sottostante era direttamente proporzionale alla loro rispettiva quantità. Sebbene il picco atteso per l’allele mutato è il 50% degli alleli di PHOX2B negli individui che hanno ereditato la mutazione, è stato osservato che il suo ammontare nel DNA dei leucociti dei genitori varia in un intervallo da 9% a 35%; questa percentuale è stata confermata negli studi sul DNA dei fibroblasti e della saliva prelevati da un sottogruppo di questi genitori mosaici (13) . Similmente, in un altro studio, gli individui mosaici sono stati identificati come “outliers”, caratterizzati da un segnale dell’allele espanso minore dell’atteso (16). Mentre in questi studi è stato dimostrato mosaicismo somatico per PARMs maggiori di 20/25, nessuno dei rari portatori asintomatici 20/25 è risultato essere un mosaico, confermando che in questi casi la mancata manifestazione del fenotipo malattia può essere dovuta ad una ridotta penetranza di una mutazione germinale. Nel complesso, questi dati supportano l’ipotesi che le PARMs germinali maggiori di 20/25 siano mutazioni a penetranza completa, e portatori asintomatici possano essere osservati solo in associazione con un grado significativo di mosaicismo somatico. Il fenotipo CCHS non è stato finora associato a nessun grado di mosaicismo somatico, suggerendo un’origine germinale per la maggior parte delle PARMs nei pazienti CCHS.

Ereditarietà nella CCHS e mutazioni PHOX2B

L’osservazione della stessa mutazione di PHOX2B in membri di una stessa famiglia CCHS e la rilevazione di mosaicismo somatico in alcuni genitori asintomatici per la mutazione osservata nei loro figli affetti chiaramente stabilisce un’eredità autosomica dominante in CCHS (3, 6). La maggior parte di genitori di bambini affetti da CCHS non sono portatori di mutazione, indicando un’alta incidenza delle mutazioni de novo negli individui affetti. Genotipi costitutivi 20/24 e 20/25 e alcuni NPARMs possono essere osservati in genitori asintomatici di bambini CCHS e in altri membri della famiglia, suggerendo che queste mutazioni sono ereditate con modalità dominante a penetranza incompleta (5, 7, 10, 11, 13, 17, 26). I famigliari portatori di tali mutazioni che non presentano il fenotipo CCHS possono manifestare un fenotipo ANSD, incluso HSCR o neuroblastoma (7, 48), o possono essere pre-sintomatici, manifestando la patologia nella tarda infanzia o nell’età adulta.

La consulenza genetica è fondamentale per gli individui diagnosticati con CCHS, per i loro genitori e, in alcuni casi, per specifici membri della famiglia. Per tutti gli individui affetti da CCHS c’è un 50% di possibilità di trasmettere la mutazione, e quindi il fenotipo malattia, alla progenie. Se un genitore non affetto è risultato essere un mosaico per una mutazione di PHOX2B (normalmente identificata per la presenza di un figlio affetto), c’è fino al 50% di possibilità di ricorrenza nei figli successivi. Per gli individui mosaici si può sempre assumere che la mutazione sia de novo (la mutazione non può essere stata ereditata in un individuo mosaico) e quindi solo i figli di questi individui (non altri famigliari) corrono il rischio di ereditare la mutazione. Se i genitori non affetti sono portatori di una mutazione costitutiva (per esempio un genotipo 20/25), ci potrebbero essere altri famigliari portatori della stessa mutazione ma privi dei sintomi CCHS. In questo caso il test genetico è suggerito per tutte le persone che per la loro posizione nell’albero genealogico possono avere la mutazione, che può essere rintracciata fino all’individuo nel quale è originariamente insorta. Per valutare il rischio di ricorrenza in una famiglia, entrambi i genitori di un bambino CCHS dovrebbero sottoporsi allo screening di PHOX2B per escludere il mosaicismo (90) (PARMs dai genotipi 20/26 fino a 20/33 e le severe NPARMs) o uno stato di portatore caratterizzato da penetranza incompleta (genotipi 20/24 e 20/25 e lievi NPARMs). L’analisi prenatale è disponibile e può essere eseguita per individui con o senza CCHS che siano portatori di mutazioni costitutive o riconosciuti come mosaici somatici. Nonostante un test negativo sui genitori di un bambino CCHS, il mosaicismo germinale non può essere mai completamente escluso e l’analisi prenatale per successive gravidanze dovrebbe essere presa in considerazione. L’analisi prenatale può fornire ai genitori ottime informazioni medianti le quali prendere una decisione consapevole con un ventaglio di possibilità a partire da un aborto terapeutico fino all’organizzazione del parto in modo che il nascituro venga immediatamente e adeguatamente assistito.

Figura 5. Differenti quantità degli alleli normale ed espanso del gene PHOX2B in portatori di PA. I picchi blu rappresentano gli alleli di un paziente affetto da Ipoventilazione Centrale Congenita (CCHS) (in alto) e di un genitore asintomatico (in basso). Mentre la posizione nell’asse delle x corrisponde alla loro lunghezza, come indicato sotto, l’altezza dei picchi è direttamente proporzionale alla loro quantità. Quindi, l’individuo in basso presenta un mosaicismo somatico per l’allele di 26 alanine (genotipo 20/26), il quale infatti risulta essere meno della metà rispetto all’allele normale (genotipo normale 20/20).

Meccanismi che producono PARMs

I tratti di polialanine (PA), al momento predetti in 500 proteine umane, si trovano preferenzialmente in fattori di trascrizione e sono considerati elementi spaziatori flessibili essenziali per la conformazione della proteina, le interazioni proteina-proteina e/o il legame al DNA. I tratti PA codificati da geni umani, oltre a PHOX2B, sono già stati identificati espansi in associazione ad almeno nove diversi disordini congeniti, incluso ritardo mentale e malformazioni del cervello, delle dita e delle strutture mediane (91). Da questo punto di vista, le espansioni di PA sono membri di una più vasta categoria di disordini dovuti ad espansioni di triplette che includono anche espansioni di poliglutammine (PQ). A differenza delle PQ, i tratti PA sono generalmente stabili (non variano di lunghezza passando da una generazione all’altra), sono di solito codificati da triplette “imperfette” (le alanine possono essere codificate da quattro diverse triplette di DNA) e, con l’eccezione delle rare contrazioni, non sono presenti come tratti polimorfici nella popolazione umana (la maggior parte dei geni “normali”-wild-type- hanno lo stesso numero di alanine). Queste osservazioni hanno suggerito il meccanismo di ricombinazione allelica ineguale tra cromosomi omologhi (crossing-over ineguale) durante la meiosi e/o mitosi come il più suggestivo per la formazione delle espansioni di polialanine (91).

Negli individui mosaici, però, sono stati osservati solo due alleli (wild-type ed espanso), invece che tre alleli (wild-type, espanso e contratto) attesi in seguito all’insorgenza di un evento somatico di crossing-over ineguale, dimostrando che un meccanismo mutazionale alternativo dovrebbe essere considerato per spiegare l’origine di queste espansioni di triplette (16, 92). In realtà, ragionando sul fatto che le sequenze di ripetizioni di triplette imperfette, tipiche delle PA, ridurrebbero la capacità delle ripetizioni di formare strutture appaiate erroneamente, lo slittamento nella replicazione (slippage) è stato proposto come meccanismo più probabile del crossing-over ineguale per la generazione di espansioni di polialanine (93).

Anche questa ipotesi è stata recentemente rivista dopo aver osservato quattro famiglie informative per marcatori di PHOX2B la cui segregazione era compatibile con l’ipotesi di uno scambio ineguale tra cromatidi fratelli. E’ probabile che le espansioni PA de novo in CCHS insorgano principalmente da questo tipo di eventi cromosomici sia durante la gametogenesi o in cellule somatiche durante uno stadio post-zigotico (94). E’ stata riportata un’origine paterna dei gameti che trasmettono le espansioni in 6 trios informativi con CCHS de novo (94), mentre in un gruppo più ampio di 20 trios, sono state osservate 13 mutazioni insorte nel cromosoma paterno e 7 sul cromosoma materno. Quindi, l’insorgenza delle espansioni di polialanine potrebbe essere indipendente dai processi di spermatogenesi o oogenesi o potrebbe esistere una lieve distorsione che, però, per essere confermata, richiederebbe l’analisi di un più ampio campione di famiglie.

Meccanismi mediante i quali le mutazioni del gene PHOX2B portano al fenotipo CCHS

Poiché è un fattore di trascrizione tessuto specifico, PHOX2B è responsabile della regolazione dell’espressione di una serie di geni bersaglio coinvolti nello sviluppo dell’ANS. La scoperta che PHOX2B lega direttamente le regioni regolatorie dei geni Dopamina Beta Idrossilasi (DBH), PHOX2A e TLX2, ha permesso l’applicazione di un approccio funzionale per svelare i meccanismi molecolari alla base della patogenesi CCHS. A questo scopo le mutazioni di PHOX2B sono state analizzate per la loro capacità di alterare la funzione normale della proteina rispetto a 1) trans attivazione di diversi promotori bersaglio, 2) legame al DNA, 3) formazione di aggregati, 4) localizzazione sub-cellulare. Sono stati ipotizzati distinti meccanismi patogenetici in CCHS per mutazioni PARMs e NPARMs. Inoltre la risposta cellulare alle espansioni di polialanine di PHOX2B è stata investigata per determinare se esistono meccanismi cellulari che possano essere modulati per limitare la citotossità di queste mutazioni.

Espansioni di polialanine (PARMs). Per investigare il modo in cui le espansioni di polialanine possono indurre la patogenesi di CCHS, è stata confrontata, in due laboratori diversi, la capacità di costrutti di espressione contenenti espansioni di PA di regolare la trascrizione di geni bersaglio noti con quella del costrutto contenente PHOX2B senza mutazioni (“wild type”). In particolare, come esemplificato nella figura 6A per il gene bersaglio DBH, quando i costrutti contenenti PHOX2B mutato erano co-transfettati con le regioni regolatorie di DBH e PHOX2A a monte del gene Luciferasi, è stata identificata una marcata correlazione inversa tra l’attività Luciferasica indotta e la lunghezza delle PA. Questo ha suggerito che la regolazione trascrizionale di questi due geni è direttamente dipendente dalla corretta struttura del gene PHOX2B contenente le 20 alanine e che tratti PA progressivamente più lunghi ne alterano la trascrizione (6, 18). Infine, utilizzando lo stesso sistema, è stata osservata una significativa riduzione della capacità transattivante dei costrutti di PHOX2B contenenti diverse contrazioni di polialanine sul promotore di DBH (72). Sfortunatamente questa osservazione non ha potuto essere replicata in un altro recipiente cellulare (6) suggerendo la necessità di ulteriori indagini prima di affermare che, nonostante dell’assenza di alcun effetto fenotipico, le contrazioni di PA risultano nell’alterazione della funzione di PHOX2B.

La microscopia a fluorescenza di cellule COS-7 esprimenti le proteine PHOX2B fuse a una molecola fluorescente verde ha dimostrato che la proteina PHOX2B selvatica è presente quasi esclusivamente nel nucleo. Al contrario, l’aumento di espansioni di polialanine induce una sempre maggiore percentuale di proteina PHOX2B a localizzarsi nel citoplasma anziché nel nucleo (Figura 7) (18). Allo stesso modo, esperimenti simili eseguiti in cellule HeLa hanno mostrato che le espansioni di polialanine inducono la formazione di aggregati, sebbene in percentuali differenti rispetto a quelle osservati in COS7 (6), suggerendo che l’errata localizzazione della proteina mutata è un meccanismo patogenetico comune risultante nella diminuita attività trascrizionale delle proteine PHOX2B contenenti le espansioni di polialanine.
Figura 6. Effetto delle mutazioni di PHOX2B sulla transattivazione della regione regolatoria di DBH. L’attività trascrizionale ottenuta co-transfettando i costrutti di espressione, riportati alla sinistra di ciascun diagramma, con un costrutto contenente il promotore di DBH clonato a monte del gene reporter Luciferasi, è mostrata in (A) per i tratti espansi di polialanine e in (B) per le mutazioni frameshift, in termini di attività Luciferasica relativa. Adattata dalla Referenza 18.

Inoltre, utilizzando saggi di mobilità elettroforetica, è stato osservato che tratti espansi contenenti da 9 a 13 alanine aggiuntive hanno effetto sul legame al DNA, probabilmente perché gli aggregati di tali proteine mutate non rendono la proteina disponibile per il legame al DNA, un’osservazione confermata in vitro dalla dimostrazione che le espansioni di PA di PHOX2B formano spontaneamente oligomeri (6). Infine l’interazione tra la proteina PHOX2B selvatica e il mutante con 33 ripetizioni (13 alanine aggiuntive) ha suggerito che le mutazioni PA possono inoltre ostacolare la funzione della proteina normale a causa di una anomala aggregazione tra le due proteine (6, 18).

Allo scopo di analizzare il destino di cellule che esprimono espansioni di polialanine di PHOX2B, esperimenti in vitro hanno dimostrato che l’attivazione della risposta “heat shock” mediata dal farmaco geldanamicina, un antibiotico presente in natura, è efficiente sia nel prevenire la formazione che nell’indurre l’eliminazione degli aggregati di PHOX2B preformati e, infine, anche nel recupero della capacità di PHOX2B di transattivare il promotore di DBH. Inoltre, è stata dimostrata l’eliminazione di proteine mutate di PHOX2B mediata dal proteasoma e dall’autofagia, due meccanismi cellulari già noti per essere coinvolti nell’eliminazione di proteine contenenti tratti espansi di poliglutammine e polialanine. E’ stata osservata apoptosi cellulare solo in associazione con le più lunghe espansioni di PA (19).

Mutazioni di PHOX2B diverse dalle espansioni di alanine (NPARMs). Le proteine PHOX2B NPARMs finora studiate hanno dimostrato una compromessa attivazione trascrizionale dei promotori DBH e TLX2, con una correlazione tra la gravità dell’alterazione trascrizionale e la lunghezza del tratto C-terminale della proteina tradotto fuori frame (vedi Figura 6B per l’effetto sul target DBH) (6, 18, 95). Inaspettatamente le mutazioni frameshifts di PHOX2B hanno mostrato un aumento dal 10% al 30% dell’attivazione regolatoria della regione regolatrice di PHOX2A (18). Inoltre, mutazioni frameshifts e missenso hanno mostrato principalmente una completa perdita di legame al DNA ma, a differenza delle lunghe espansioni di polialanine, si localizzano correttamente nel nucleo (Figura 7) (6, 18).

Regioni C-terminali aberranti possono causare una disfunzione della proteina PHOX2B dovuta o alla perdita della capacità di formare corrette interazioni proteina-proteina con partners molecolari o all’acquisto di legami con proteine errate, un’ipotesi interessante alla luce dell’associazione delle mutazioni NPARMs con il rischio di sviluppare neuroblastoma (96). In accordo, uno studio recente ha dimostrato che costrutti contenenti mutazioni NPARMs mantengono la capacità di inibire la proliferazione cellulare ma senza promuovere il differenziamento (20), suggerendo un meccanismo che potrebbe promuovere lo sviluppo di tumori delle creste neurali.

In conclusione, questi studi indicano una differenza tra le mutazioni PARMs e le mutazioni frameshift NPARMs in termini di transattivazione dei promotori targets, formazione di aggregati e localizzazione sub-cellulare. Futuri studi in vitro forniranno ulteriori indizi sulla patogenesi e possibili indicazioni per una eventuale terapia.

Figura 7. Localizzazione subcellulare delle diverse varianti mutate della proteina PHOX2B. Nel pannello a destra, sono riportate le tre possibili localizzazioni cellulari di PHOX2B: (N) solo nucleare; (N+C) nucleare e citoplasmatica, diffusa o con formazione di aggregati nucleari e/o citoplasmatici; e (C) localizzazione solo citoplasmatica. Nell’istogramma a sinistra è riportata la distribuzione subcellulare delle proteine PHOX2B-GFP, in seguito a transfezione di costrutti di diverse mutazioni di PHOX2B: 25Ala, 29 Ala, 33Ala (sopra) e c.930insG, c.614-618delC (sotto). Adattata dalla Referenza 18.

Aspetti clinici della CCHS

Diagnosi e decorso clinico

Prima del 2003 con la scoperta che il PHOX2B, il gene che caratterizza la malattia, lo spettro clinico della severità della malattia, in termini di ipoventilazione ed altri aspetti del fenotipo ANSD, ha per lungo tempo confuso i clinici. Una volta che la diagnosi di CCHS è presa in considerazione si deve effettuare un prelievo di sangue per la ricerca del test di screening per il gene PHOX2B ( vedi Fig. 8). Nel caso che l’esame sia negativo ed il fenotipo del paziente supporti la diagnosi di CCHS o LO-CCHS, o nel caso che sia il medico che la famiglia vogliano essere sicuri sulla diagnosi di CCHS dovrebbe essere eseguito il test sulla sequenza del PHOX2B. (Eventuali riferimenti www.genetest.org). Effettuare due livelli di test è il modo migliore per ottenere il miglior rapporto costo- beneficio. (la mutazione nel 95% dei casi di CCHS sarà identificata con il più economico test di screening del gene PHOX2B e solo una parte dei NPARMs richiederà per essere identificato il test sulla sequenza del PHOX2B).Mentre si aspettano i risultati del test del PHOX2B (alta sensibilità e specificità) andrebbero cercate altre cause di ipoventilazione per un rapido trattamento e per una corretta strategia di cura domiciliare. Malattie primitive del polmone, debolezza dei muscoli respiratori e malattie cardiache devono essere ricercate con i seguenti esami: Radiografia del torace, eventualmente TAC toracica, valutazione neurologica ed eventuale biopsia muscolare ed ecocardiogramma. Importanti problemi encefalici dovrebbero essere ricercati con risonanza magnetica e TAC (97, 98), inoltre anche problemi congeniti del metabolismo dovrebbero essere esclusi con un completo screening metabolico.Oltre alle anomalie del controllo respiratorio, i bambini con CCHS, hanno altri sintomi di diffusa disregolazione autonomica (27, 28). Per quelli con costipazione un clisma opaco o una manometria e una biopsia rettale dovrebbero essere effettuati per diagnosticare HSCR (99). Esami seriati del torace e dell’addome sono essenziali tra i bambini con la NPARMs e tra i bambini con il genotipo 20/29 o 20/33 per per escludere un tumore della cresta neurale, in particolare il neuroblastoma ( NPARMs) e ganglio neuroblastoma/ganglioneuroma ( PARMs) (100). Poiché nessun bambino con i genotipi da 20/24 a 20/28 ha mai presentato tumori della cresta neurale il significato dello studio radiologico ad immagini seriate, in questi casi è sconosciuto. Sono state descritte anormalità del ritmo cardiaco, inclusa una ridotta variabilità della frequenza cardiaca, una ridotta aritmia respiratoria e una brusca asistolia transitoria (9, 101, 102). Un controllo Holter cardiologico di 72 ore ogni anno può dimostrare ritmi cardiaci aberranti, pause del seno che necessitano l’impianto di pace-maker cardiaco bipolare (103) e la frequenza di brevi pause (più brevi di 3 s) che possono avere impatto fisiologico e neurocognitivo.<